Penelitian DNA Mutakhir

Judul    : Barcode DNA Edelweis (Anaphalis javanica) Berdasarkan Gen maTK

Penulis : Muzakir Rahalus, Maureen Kumaunang, Audy Wuntu, Julius Pontoh

Alamat : Jurusan Kimia, FMIPA, Unsrat, Manado

Sumber : Rahalus,Muzakir, dkk. (2015). “Barcode DNA Edelweis (Anaphalis javanica) Berdasarkan Gen maTK”.  Jurnal MIPA UNSRAT Online.4 (2), 131-136.

Abstrak       

DNA barcode merupakan metode identifikasi organisme hidup dengan menggunakan urutan DNA pendek (± 500 pasang basa). Tujuan dari penelitian ini adalah memperoleh barcode DNA Edelweis dan menganalisis kemiripan gen matK Edelweis (Anaphalis javanica) dengan kerabat terdekatnya. Isolasi DNA total Edelweis berhasil dilakukan dengan menggunakan manual prosedur dari InnuPrep Plant DNA Kit yang dimodifikasi. Gen matK parsial telah diisolasi dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan Primer forward matK-1RKIM-f dan Primer Reverse matK-3FKIM-r. Hasil analisis sekuens menghasilkan barcode DNA edelweis berukuran 843 bp. Hasil analisis kemiripan menunjukkan tingkat kekerabatan terdekat dengan A. margaritaceae yaitu 99.86% pada BOLD System dan 100 % pada NCBI.

Kata kunci : edelweis, matK, barcode DNA, analisis kekerabatan

      Anaphalis javanica, dikenal secara populer sebagai Edelweis jawa (Javanese edelweiss) atau Bunga Senduro yang biasanya hidup di pegunungan dengan ketinggian antara 1.600-3.600 mdpl. Ekstrak eldeweis ini sangat berguna bagi kesehatan manusia, seperti obat penyakit disentri, diare dan TBC serta anti penuaan karena mengandung antioksidan dan antimikroba. Akan tetapi, banyak pendaki yang mengambil bunga ini tanpa memperhatikan kelestariannya sehingga dikhawatirkan bunga ini akan punah. Sebagai langkah awal agar dapat menumbuhkan, mengembangkan, dan merekayasa secara genetik edelweis sebagai tanaman kesehatan produktif, maka diperlukan teknik molekuler, salah satunya Polymerase Chain Reaction (PCR) dimana membutuhkan DNA dengan jumlah yang cukup dan kualitas yang baik. Oleh karena itu, dibutuhkan prosedur isolasi yang optimum agar diperoleh DNA genom yang dapat digunakan sebagai bahan dalam analisis molekuler. Salah satu aplikasi analisis molekuler adalah dalam penentuan spesies mahluk hidup. Metode identifikasi spesies makhluk hidup sudah berkembang sampai pada identifikasi molekuler berdasarkan potongan DNA pendek yang disebut’’barcode DNA” yang berfungsi sebagai konfirmasi sampel-sampel tanaman obat. Barcode DNA ini menggunakan sekuens DNA dari gen maturase K (matK) yang terdapat dalam kloroplas sebagai gen standar.

Metode :

a)       Isolasi DNA

Isolasi DNA total edelweis dilakukan berdasarkan prosedur manual InnuPrep Plant DNA Kit yang dimodifikasi. Sampel ederwis yang telah digerus melalui serangkaian tahap dari inversi, inkubasi, ditambahkan berbagai bahan penunjang kemudian disentrifugasi dimana akan menghasilkan larutan DNA yang akan disimpan dalam freezer.

b)       Amplifikasi matK Edelweis menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR master mix dibuat dengan menggunakan GoTaq®Green Master Mix (Promega). Mesin PCR direaksikan dengan berbagai komponen atau bahan kemudian mengalami siklus amplifikasi yang terdiri dari tahap denaturasi, penempelan primer, dan polimerase. Hasil PCR kemudian dielektroforesis dan ditentukan urutan nukleotidanya. Hasil PCR dikirim ke Malaysia (First Base Pte.) untuk dilakukan proses pengurutan nukleotida (sekuensing).

c)     Elektroforesis agarosa

Elektroforesis dilakukan untuk melihat keberhasilan proses PCR. Setelah melalui serangkaian tahap mulai dari pemanasan, pendinginan, serta penambahan bahan tertentu, gel agarosa diletakkan dalam alat elektroforesis kemudian ditambahkan dengan hasil PCR. Hasil elektroforesis divisualisasikan menggunakan UV-Transiluminator pada panjang gelombang λ = 312 nm dan didokumentasikan.

d)     Analisis Hasil

Kromatogram DNA hasil sekuensing disunting menggunakan software Geneious v5.6. Hasil sekuensing yang menggunakan primer reverse dilakukan proses reverse and complement kemudian dipadukan dengan hasil sekuensing primer forward menggunakan Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation (MUSCLE). Keakuratan amplifikasi gen target diuji dengan memprediksi urutan asam amino berdasarkan sekuens matK untuk melihat adanya kodon stop di tengah sekuens gen-gen aktif tersebut sehingga diketahui pasti bahwa yang teramplifikasi bukan gen semu (pseudo gen). Potongan gen matK diidentifikasi lewat Barcode of Life Database (BOLD) system. Selanjutnya dilakukan analisis kekerabatan edelweis (A. javanica) menggunakan program BLASTn pada National Center for Biotechnology Information (NCBI)

Hasil dan Pembahasan

a)       Isolasi DNA dan Amplifikasi matK Edelweis

Isolasi DNA total edelweis dilakukan untuk memperoleh templat DNA dalam proses amplifikasi gen matK edelweis. Proses PCR telah berhasil mengamplifikasi matK edelweis yang ditunjukkan melalui hasil elektroforesis seperti dalam Gambar 1. Hasil elektroforesis menunjukkan adanya pita DNA yang jelas dan tebal sebagai bukti keberhasilan amplifikasi matK. Hasil PCR ini selanjutnya disekuensing untuk mengetahui urutan nukleotida matK edelweis.

Gambar 1. Elektroforegram pita DNA hasil elektroforesis (S: sampel, M: marker DNA ladder)

b)       Analisis Urutan Nukleotida matK dan Penentuan Barcode DNA Edelweis

Panjang hasil sekuensing (pengurutan) DNA edelweis (A. javanica) dari matK forward adalah 868 bp, sedangkan matK reverse setelah pembalikan 867 bp. Penjajaran antara matK forward dan matK reverse 901 bp. Hasil sekuens yang telah dipotong ± 30 bp pada awal dan akhir untai DNA, menghasilkan sekuens baru (Gambar 2).

Pengujian terhadap asam amino pengkode dari sekuens DNA kloroplas ini menunjukkan tidak adanya kodon stop di tengah-tengah sekuens. Hal ini membuktikan bahwa hasil amplifikasi DNA yang dilakukan sudah valid. Pembacaan gen matK menggunakan frame 3 yaitu pembacaan dimulai dari asam amino yang ketiga.

Gambar 2. Sekuens barcode DNA matK dan Asam Amino A. Javanica

c)       Analisis Hubungan Kekerabatan Edelweis

Berdasarkan hasil penelusuran BOLD System, terdapat 99 jenis urutan nukleotida yang mempunyai kemiripan dengan A. javanica yang terurut dari rank pertama (1) sampai rank ke (99) sesuai panjang sekuens pasangan basa. Hasil penelusuran juga tidak ditemukan kemiripan sampai 100% (identik). Keseluruhan 99 nukleotida matK berbagai organisme yang berhasil dideteksi melalui BOLD System memilki variasi tingkat kemiripan. Beberapa organisme memiliki tingkat kemiripan yang tinggi, yaitu > 99 % walaupun dari genus yang berbeda, namun masih berada dalam satu famili Asteraceae. Spesies yang kemiripannya sangat tinggi dan masih satu genus dengan A. javanica yaitu A. margaritaceae dengan tingkat kemiripan 99,88 % dengan panjang sekuens 817 bp (dapat dilihat di rank ke 11 pada Gambar 3, yang diberi kotak).

Gambar 3. Penelusuran BOLD system untuk sekuens matK Edelweis (A. javanica)

Berdasarkan hasil analisis BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool – nucleotida), ditemukan bahwa matK A. javanica memiliki kemiripan terdekat dengan A. margaritaceae sebesar 99% (Gambar 4, urutan pertama), sehingga memperkuat hasil analisis BOLD System. Kemiripan ini juga diperkuat dengan melihat pohon kekerabatan A. javanica yang berada satu root dengan A. margaritacea (Gambar 5).

Gambar 4. Hasil analisis BLASTn matK A. Javanica

Gambar 5. Pohon kekerabatan A. Javanica

Kesimpulan

Barcode DNA Edelweis (Anaphalis javanica) telah diperoleh dengan panjang sekuens 843 pb berdasarkan gen matK. Hasil analisis kekerabatan menunjukkan bahwa Edelweis (A. javanica) memiliki kerabat terdekat dengan A. margaritacea, dengan tingkat kemiripan 99%.